背景：血清代謝組是與乳腺癌風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)的分子生物標(biāo)志物的潛在來源。在這里，我們旨在分析從參與挪威特倫德拉格健康研究（HUNT2研究）的健康女性收集的診斷前血清樣本中存在的代謝物，這些女性可以獲得有關(guān)患乳腺癌的長期信息。

方法：選擇參與HUNT2研究且在15年隨訪期內(nèi)患乳腺癌的女性（BC病例）和年齡匹配且保持無乳腺癌的女性（n=453例對照）。使用高分辨率質(zhì)譜方法定量分析了284種化合物，包括30種氨基酸和生物胺、己糖和253種脂質(zhì)（?；鈮A、甘油酯、磷脂酰膽堿、鞘脂和膽固醇酯）。

結(jié)果：年齡是導(dǎo)致數(shù)據(jù)集中較大異質(zhì)性的主要混雜因素，因此單獨(dú)分析了年齡定義的亞組。在年輕女性亞組（<45歲）中觀察到血清水平區(qū)分BC病例和對照組的代謝物數(shù)量最多（82種化合物）。值得注意的是，甘油酯、磷脂酰膽堿和鞘脂水平升高與年輕和中年女性（≤64歲）患癌癥的風(fēng)險(xiǎn)降低有關(guān)。另一方面，血清脂質(zhì)水平升高與老年女性（>64歲）患乳腺癌的風(fēng)險(xiǎn)增加有關(guān)。此外，在樣本采集后早期（<5歲）和更晚（>10年）診斷的BC病例之間，可以檢測到幾種代謝物的血清水平不同，但這些化合物也與參與者的年齡相關(guān)。目前的結(jié)果與在HUNT2參與者隊(duì)列中進(jìn)行的基于NMR的代謝組學(xué)研究的結(jié)果一致，其中血清VLDL亞組分水平升高與絕經(jīng)前婦女患乳腺癌的風(fēng)險(xiǎn)降低有關(guān)。

結(jié)論：在診斷前血清樣本中檢測到的代謝物水平的變化反映了脂質(zhì)和氨基酸代謝受損，以年齡依賴性方式與乳腺癌的長期風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)。

1引言

乳腺癌（BC）是目前最常見的惡性腫瘤，女性癌癥相關(guān)死亡人數(shù)最多。2020年，全球有超過200萬例新病例和約685,000例死亡;到2040年，這兩個數(shù)字預(yù)計(jì)將增加40-50%。通過限制暴露于危險(xiǎn)因素進(jìn)行一級預(yù)防是減少不列顛哥倫比亞省病例數(shù)量的最有效措施，其中包括通過適當(dāng)?shù)捏w重、飲食、身體活動以及避免吸煙和飲酒來保持健康的生活方式。二級預(yù)防，即早期發(fā)現(xiàn)疾病，可進(jìn)一步降低與BC相關(guān)的死亡率。為了增加成功治療的機(jī)會，1980年代和1990年代在幾個發(fā)達(dá)國家引入了BC篩查計(jì)劃。主要使用影像學(xué)檢查，例如乳房X線攝影、超聲和磁共振成像，但也有其缺點(diǎn)。例如，乳房X光檢查是BC篩查中的金標(biāo)準(zhǔn)，可產(chǎn)生高百分比的假陽性結(jié)果，在某些情況下結(jié)果不太可靠。因此，有必要找到具有高靈敏度和特異性的微創(chuàng)方法，即使在生物醫(yī)學(xué)圖像中可見病理變化之前，也能檢測出BC。

代謝組學(xué)為癌癥診斷創(chuàng)造了新的機(jī)會，代謝組學(xué)是一門涉及研究人體中動態(tài)變化最大的系統(tǒng)-代謝組的科學(xué)。核磁共振（NMR）波譜和質(zhì)譜（MS）是代謝組學(xué)中最常用的兩種分析技術(shù)。通過分析血液和其他生物樣本中的代謝物，甚至可以檢測與疾病發(fā)展相關(guān)的細(xì)微變化，包括BC。幾項(xiàng)研究報(bào)告稱，血清/血漿代謝組分析可用于提供與BC風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)的特征。一些嵌套病例對照研究比較了從基線時(shí)無癌癥的女性收集的診斷前樣本，然后在幾年的隨訪中發(fā)展為乳腺癌，并匹配保持健康的女性。這些研究表明，乳腺癌風(fēng)險(xiǎn)的增加與某些氨基酸或性類固醇代謝物（特別是絕經(jīng)后婦女）的水平增加有關(guān)。另一方面，觀察到BC風(fēng)險(xiǎn)與磷脂酰膽堿、溶血磷脂酰膽堿、膽固醇酯和其他脂質(zhì)化合物的血清/血漿水平呈負(fù)相關(guān)。然而，個體代謝物的重要性因研究而異，并且尚未提出乳腺癌風(fēng)險(xiǎn)的共同代謝特征。

最近，我們小組發(fā)表了一項(xiàng)使用基于NMR的代謝組學(xué)方法對挪威女性人群進(jìn)行乳腺癌風(fēng)險(xiǎn)評估的研究結(jié)果。血清代謝物和脂質(zhì)分析包括來自挪威特倫德拉格健康研究（HUNT2研究）的大量健康女性（超過2400人）。該分析能夠檢測血清脂蛋白亞組分，其水平區(qū)分了在采血幾年后被診斷患有BC的參與者和在同一隨訪期間仍未出現(xiàn)BC的參與者。值得注意的是，觀察到幾種極低密度脂蛋白（VLDL）亞組分與乳腺癌風(fēng)險(xiǎn)之間的負(fù)相關(guān)主要在絕經(jīng)前婦女中觀察到。在目前的研究中，我們旨在驗(yàn)證這一觀察結(jié)果，并使用基于高分辨率MS的靶向方法對血清中的脂質(zhì)成分進(jìn)行深入分析。目前的分析包括來自HUNT2研究的453名健康參與者的預(yù)診斷材料，這些參與者在15年的觀察期間被診斷出患有BC，以及453名匹配的女性，她們在這次隨訪期間仍然沒有癌癥。這允許檢測被認(rèn)為與乳腺癌風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)的成分。

2材料與方法

2.1研究對象

我們研究中使用的材料來自挪威特倫德拉格健康研究的第二部分，其中包括約65,000名健康參與者[HUNT2研究;在1995年至1997年期間收集血清樣本，并儲存在-80°C直至分析。2019年進(jìn)行的HUNT2參與者與挪威癌癥登記處的匹配允許識別出1208名在22年隨訪期內(nèi)患乳腺癌的女性（癌癥診斷的平均時(shí)間為11.7年）。對于每個乳腺癌病例（BC），隨機(jī)選擇一名在整個隨訪期間保持無乳腺癌的參與者作為對照（Ctr），與納入HUNT2時(shí)的年齡相匹配。對于目前的分析，首先將上述一組婦女分成亞組，這些婦女在納入后一年的隨訪中被診斷患有乳腺癌（連同其匹配的對照組），然后從0-1年到14-15年的每個一年間隔中隨機(jī)選擇30（或31）個病例對照對。這確保了病例對照對的數(shù)量與診斷時(shí)間成比例地增加。所有HUNT2參與者都填寫了書面知情同意書，該研究已獲得挪威中部倫理委員會的批準(zhǔn)（REKNo#1995/8395和#2017/2231）。研究中包括的453例病例和453例對照的基線特征如表1示。

表1研究隊(duì)列的基線特征

2.2LC-MS靶向代謝組學(xué)

研究選擇Absolute IDQ p400HR試劑盒用于代謝物進(jìn)行靶向定量分析。該試劑盒可定量測量多達(dá)408種化合物（或其異構(gòu)體基團(tuán)），涵蓋11類代謝物（包括氨基酸、生物胺、己糖、?；鈮A、甘油二酯和甘油三酯、（溶血）磷脂酰膽堿、鞘脂和膽固醇酯），這要?dú)w功于直接流向注射和液相色譜（LC）與質(zhì)譜（MS）的結(jié)合。使用配備為1290InfinityUHPLC（Agilent）系統(tǒng)的OrbitrapQExactivePlus光譜儀（ThermoFisherScientific）進(jìn)行MS分析;Xcalibur4.1軟件（ThermoFisherScientific）控制整個系統(tǒng)。通過使用Xcalibur4.1處理注冊的光譜和色譜圖來確定代謝物的濃度（μM）。和MetIDQDB110-2976軟件（BiocratesLifeSciences）。

2.3數(shù)據(jù)處理

代謝組學(xué)數(shù)據(jù)集由906個樣本組成，每個樣本由389種代謝物的測量水平描述。在數(shù)據(jù)集中檢測到兩種類型的缺失值：（i）低于檢測限的值（即非隨機(jī)缺失）和（ii）由于內(nèi)標(biāo)誤差而缺失的測量值（即完全隨機(jī)缺失）。根據(jù)建議，所有樣本中50%和10%的缺失值分別允許任何一種類型的誤差;否則，該化合物被排除在進(jìn)一步分析之外。符合定量分析條件的最終數(shù)據(jù)集包括284種代謝物;對于105種代謝物，超過了可接受的缺失值數(shù)量的閾值。使用經(jīng)驗(yàn)貝葉斯方法對284種代謝物的最終數(shù)據(jù)集進(jìn)行批量校正。我們假設(shè)使用一個96孔樣品制備板測量的樣品代表一個批次。在批量調(diào)整之前，使用對數(shù)基數(shù)2函數(shù)轉(zhuǎn)換數(shù)據(jù)。對批量校正的數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，以進(jìn)行缺失值插補(bǔ)。將低于檢測限的值替換為從正態(tài)分布生成的隨機(jī)數(shù)，該隨機(jī)數(shù)被截?cái)酁榻橛?span lang="EN-US">0和所有測試板定量限的中值之間的片段。其他缺失的測量值（完全隨機(jī)缺失）由使用k最近鄰方法插補(bǔ)的值填充;使用相關(guān)距離指標(biāo)識別最近的觀測數(shù)據(jù)，并使用三個最近鄰的平均值[基于為同一組（病例或?qū)φ眨┦占臏y量值]。

2.4統(tǒng)計(jì)和生物信息學(xué)分析

未來乳腺癌患者和對照組之間基線特征的差異采用連續(xù)變量的Studentt檢驗(yàn)和分類變量的Pearson卡方檢驗(yàn)進(jìn)行檢驗(yàn)。應(yīng)用Mann-WhitneyU檢驗(yàn)來檢驗(yàn)被分析的個體組之間在符合定量分析條件的284種化合物的測量水平上差異的統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性。應(yīng)用Benjamini-Hochberg程序來最大程度地減少假陽性結(jié)果的數(shù)量。所有統(tǒng)計(jì)假設(shè)均在5%顯著性水平上進(jìn)行檢驗(yàn)。此外，在Mann-WhitneyU檢驗(yàn)之后，“r”效應(yīng)大小根據(jù)以下公式計(jì)算：r=z2√N=2（其中z是檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)量的值，N是兩個比較組中的觀測值總數(shù)）和Cohen準(zhǔn)則的解釋（r≤0.1表示可忽略不計(jì)的效應(yīng)量）。對剩余的105種代謝物不合格進(jìn)行定量分析，采用卡方獨(dú)立性檢驗(yàn)來測試給定化合物的不存在/存在狀態(tài)是否與組相關(guān)特征。此外，還計(jì)算了Spearman的秩相關(guān)系數(shù)，以確定代謝物水平與納入或癌癥診斷時(shí)的年齡之間的關(guān)聯(lián)程度。使用高斯混合模型確定了三個與年齡相關(guān)的參與者亞組（即年輕、平均、年長）。使用無條件邏輯回歸計(jì)算每個變量濃度增加一個標(biāo)準(zhǔn)差（SD）的比值比（OR）和95%Wald置信區(qū)間（CI）;Logistic回歸模型分別擬合了三個與年齡相關(guān)的女性亞組。使用偏最小二乘判別分析（PLS-DA）擬合多變量預(yù)測模型，以區(qū)分與年齡相關(guān)的女性亞組的病例和對照組。選擇給出最小交叉驗(yàn)證測試誤差（內(nèi)循環(huán)）的潛在變量（LV）的數(shù)量;使用雙十倍交叉驗(yàn)證對模型進(jìn)行驗(yàn)證，其中30%的樣本包含在內(nèi)環(huán)和外環(huán)的測試集中，并通過排列測試（1000個排列）評估其顯著性（Pperm≤0.05）。對所有定量數(shù)據(jù)使用MetaboAnalyst5.0平臺進(jìn)行代謝途徑富集分析。

3結(jié)果

通過基于質(zhì)譜的方法在一組從參與HUNT2人群研究的健康女性收集的906份血清樣本中分析代謝物譜。該研究組包括453名在隨訪期間患乳腺癌的女性和453名在隨訪期間仍未患乳腺癌的年齡匹配女性（之后分別為BC和Ctr）。研究隊(duì)列的基線特征見表1。根據(jù)提供的數(shù)據(jù)，在研究隊(duì)列中，兩個已知的流行病學(xué)因素與乳腺癌風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)：對照組的多胎妊娠更頻繁（p=0.004），而BC病例的激素替代療法（HRT）的全身使用更頻繁（p=0.004）。檢出代謝物389種，其中284種化合物在大部分樣品中進(jìn)行了定量分析，包括30種氨基酸和生物胺、1種糖（己糖）和253種脂質(zhì)或其同位素基團(tuán)（32種?；鈮A、56種甘油酯、119種甘油磷脂、32種鞘脂和14種膽固醇酯）。當(dāng)總體評估兩個主要組之間定量化合物血清濃度的差異時(shí)，在多次測試校正后沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)上的顯著差異;同樣，所有化合物的差異效應(yīng)大小可以忽略不計(jì)。

3.1血清代謝物水平與參與者的年齡相關(guān)

定量化合物的平均濃度和參與者組之間的差異強(qiáng)度如圖1A所示（并在補(bǔ)充表S1中指定）。此外，剩余的105種代謝物不符合定量分析的缺失/存在狀態(tài)測試，兩組之間沒有顯示出任何差異（同樣，在進(jìn)一步進(jìn)行的任何其他比較中都沒有檢測到這種差異;未顯示）。所有906個樣品的主成分分析（PCA）顯示出較大的異質(zhì)性（圖1B），根據(jù)BC和對照組沒有明確的聚類。有趣的是，我們發(fā)現(xiàn)參與者的年齡是導(dǎo)致觀察到的變化的主要因素，如圖1C所示。隨后，我們注意到參與者的年齡與血清代謝物濃度之間存在很強(qiáng)的相關(guān)性（圖1D），這與BC或Ctr狀態(tài)無關(guān)（補(bǔ)充表S2和補(bǔ)充圖S1）。這種相關(guān)性體現(xiàn)在血清脂質(zhì)的聚集濃度上——在老年婦女中通常觀察到總脂質(zhì)濃度增加（圖1E）;重要的是，在考慮主要脂質(zhì)類別時(shí)，只有溶血磷脂酰膽堿（LPC）的總水平與年齡無關(guān)。

圖1HUNT2研究參與者血清代謝組表征

（A）在15年隨訪（BC）期間被診斷患有乳腺癌的453名參與者和453名在此期間保持無癌癥的年齡匹配女性的診斷前血清樣本中的代謝物水平（Ctr）;熱圖表示每組中分析代謝物的平均水平（表示為z分?jǐn)?shù)）和組間差異的顯著性（表示為“r”效應(yīng)大?。?b>（B）–樣品之間一般相似性的主成分分析（PCA）;被診斷患有癌癥或仍然沒有癌癥的女性樣本被單獨(dú)標(biāo)記（大圓圈代表每組的平均值）。（C）–總共906個樣本中的PCA，隨后分別標(biāo)記參與者年齡的十分位數(shù)。（D）–血清代謝物濃度與研究參與者年齡（所有參與者一起）之間相關(guān)性的重要性。（E）–所有分析脂質(zhì)的總濃度與研究參與者年齡的相關(guān)性（對照組和BC病例分別標(biāo)記）。

3.2發(fā)展為乳腺癌的參與者和對照組的血清代謝組特征不同

考慮到代謝物濃度與受試者年齡之間的強(qiáng)相關(guān)性，我們分析了較小年齡亞組中BC組和Ctr組之間的差異，以限制與年齡相關(guān)的差異。我們假設(shè)可以假設(shè)區(qū)分三個年齡定義的亞組：“低于平均水平的年輕水平”、“平均/中年”和“高于平均水平”。根據(jù)研究隊(duì)列中的實(shí)際年齡分布，這三個亞組被確定為高斯混合模型的組成部分：45歲以下（112BC/Ctr對）、45-64歲（206BC/Ctr對）和64歲以上（135BC/Ctr對），如圖2A所示。在對研究隊(duì)列進(jìn)行這樣的拆分后，檢測到BC病例和對照組之間具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著差異的幾種化合物。一般而言，對于123種化合物，在任一年齡定義的亞組中，效應(yīng)大小都高于可忽略不計(jì)的（r>0.1）（補(bǔ)充表S3）。值得注意的是，BC病例和對照組之間最大的差異是年輕女性（<45歲）：82種化合物的r>0.1（效應(yīng)量中位數(shù)等于0.068）。對于剩下的兩個亞組，45-64歲和>64歲的分別有16和52種分化化合物（效應(yīng)大小的中位數(shù)等于0.042和0.046）（圖2B）。圖2C中描述了三個年齡定義的亞組中BC病例和對照組之間的差異，以顯示主要類別血清脂質(zhì)的總濃度。一般來說，除LPC外，脂質(zhì)濃度隨著年齡的增長而增加，然而，BC病例和對照組之間的差異在年齡定義的亞組中更具異質(zhì)性。對于年輕和中年女性，BC病例的脂質(zhì)濃度通常較低（LPC除外）。有趣的是，與磷脂酰膽堿（PC）相比，在隨訪期間最終患上乳腺癌的年輕女性（<45歲）中，LPC濃度增加，這導(dǎo)致總體LPC與PC比率更高。另一方面，對于老年女性（>64歲），BC病例的脂質(zhì)濃度（尤其是甘油酯）通常較高。

圖2HUNT2研究的年輕和年長參與者血清中的代謝組譜

（A）被選中進(jìn)行分析的參與者的年齡分布（所有參與者一起）;通過高斯混合模型的組成部分識別出三個亞組：<45歲、45-64歲和>64歲（下圖）。（B）–代謝物的分布顯示BC病例和對照組在三個年齡定義的參與者亞組中差異顯著性增加（垂直線代表效應(yīng)大小的中位數(shù)）。（C）BC病例和對照組之間不同類別脂質(zhì)的總濃度差異（在三個年齡定義的參與者亞組中）;主題標(biāo)簽至少標(biāo)記了較小的效應(yīng)量。（D）在年齡定義的亞組隨訪期間，所選代謝物濃度增加與乳腺癌風(fēng)險(xiǎn)之間關(guān)聯(lián)的比值比（和95%置信區(qū)間）。（E）年輕參與者亞組（<45歲）中通過HR-MS測量的血清脂質(zhì)濃度（當(dāng)前研究）與NMR測量的脂蛋白顆粒水平（Debik等人，2021年）之間的相關(guān)性;顯示BC組和Ctr組之間至少具有較小效應(yīng)量差異的脂質(zhì)（r>0.1）和調(diào)整p值<0.05的脂蛋白顆粒（AC–?；鈮A、DG–甘油二酯、CE–膽固醇酯、Cer–神經(jīng)酰胺、FC–游離膽固醇、LPC–溶血磷脂酰膽堿、PC–磷脂酰膽堿、PL–磷脂、SM–鞘磷脂、TG–甘油三酯）。

3.3在年輕女性中，較高濃度的血清脂質(zhì)可降低患乳腺癌的風(fēng)險(xiǎn)

為了進(jìn)一步評估乳腺癌風(fēng)險(xiǎn)與血清代謝物濃度之間的關(guān)聯(lián)，分別估計(jì)了每個年齡亞組中所有284種化合物的比值比（具有95%置信區(qū)間）。盡管一些特定的代謝物顯示出與癌癥風(fēng)險(xiǎn)的一些關(guān)聯(lián)，但在所有年齡定義的亞組中通常都很弱（補(bǔ)充圖S2）。此外，還估計(jì)了主要類別血清脂質(zhì)的總濃度的比值比（圖2D）。我們觀察到，在年輕和中年女性的亞組中，甘油酯（DG和TG）、磷脂酰膽堿和鞘脂濃度的增加通常與癌癥風(fēng)險(xiǎn)降低有關(guān)。另一方面，甘油酯和神經(jīng)酰胺增加最多的脂質(zhì)（LPC）濃度增加與老年婦女亞組患癌癥的風(fēng)險(xiǎn)增加有關(guān)。然而，這些關(guān)聯(lián)中只有少數(shù)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義：<45歲亞組的TG和SM，而45-64歲亞組的DG、TG和Cer。此外，我們應(yīng)用偏最小二乘判別分析（PLS-DA）來區(qū)分BC病例和對照組的年齡定義的女性亞組（補(bǔ)充圖S3）。該分析顯示分類模型的預(yù)測準(zhǔn)確性較低，在52%至55%之間（在老年婦女組中最高），只有老年婦女的模型具有顯著性（Pperm<0.05）。

3.4與乳腺癌風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)的脂質(zhì)與脂蛋白亞組分相關(guān)

我們觀察到，BC病例和對照組之間的血清脂質(zhì)濃度差異在年輕女性（45歲以下）亞組中更為常見，這些女性被推定為絕經(jīng)前（大多數(shù)研究參與者缺少實(shí)際的絕經(jīng)狀態(tài)）。因此，這一觀察結(jié)果與我們之前在HUNT2研究參與者隊(duì)列中進(jìn)行的基于NMR的代謝組學(xué)研究的結(jié)果一致。在該研究中，觀察到絕經(jīng)前婦女（實(shí)際狀態(tài)或年齡低于51歲）的幾種VLDL亞組分和甘油三酯水平（總血清水平和HDL4TG）與乳腺癌的長期風(fēng)險(xiǎn)之間的負(fù)相關(guān)。因此，為了加深對這種效應(yīng)的了解，檢索了本研究中所有906名女性的NMR檢測到的脂蛋白水平數(shù)據(jù)。所有NMR評估的脂質(zhì)顆粒和MS評估的脂質(zhì)種類之間的一般相關(guān)性在補(bǔ)充圖S4中描述。正如人們所預(yù)料的那樣，我們觀察到大多數(shù)血清甘油酯（DG和TG）的濃度與VLDL、中密度脂蛋白（IDL）和含甘油三酯的高密度脂蛋白（HDL-TG）的濃度之間存在很強(qiáng)的正相關(guān)關(guān)系。我們還發(fā)現(xiàn)一些膽固醇酯（例如CE（16：1）和CE（18：3））和酰基烷基磷脂酰膽堿（A-AG-磷酸膽堿）的濃度與低密度脂蛋白（LDL）和HDL水平之間存在很強(qiáng)的正相關(guān)關(guān)系。此外，幾種鞘脂（SM和神經(jīng)酰胺）與VLDL、LDL和HDL-TG顆粒的水平相關(guān)。在下一步中，我們搜索了選定血清脂質(zhì)濃度之間的相關(guān)性，這些濃度顯示年輕女性亞組（<45歲，至少效應(yīng)量較?。┑?span lang="EN-US">BC病例和對照組之間存在顯著差異，而脂蛋白亞組分（主要是VLDL亞組）的水平與絕經(jīng)前婦女亞組的乳腺癌風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)。如圖2E所示。一般來說，在差別性脂蛋白亞組分和差別性甘油三酯之間觀察到很強(qiáng)的關(guān)聯(lián)。然而，差別性VLDL顆粒的水平也與某些差別性膽固醇酯、磷脂酰膽堿、神經(jīng)酰胺和鞘磷脂（圖2E中標(biāo)記的化合物）的濃度呈正相關(guān)，這表明它們存在于感興趣的脂蛋白（亞）組分中。

3.5乳腺癌的早期和晚期診斷與血清代謝組譜相關(guān)

本研究的參與者選擇方法（即，在樣本收集與相應(yīng)對照匹配的不同時(shí)間間隔內(nèi)被診斷患有癌癥的BC病例的均勻分布）旨在分析癌癥診斷時(shí)間是否影響BC組和Ctr組之間觀察到的分子差異。因此，在下一步中，我們比較了BC病例和對照組之間的差異，其中乳腺癌被診斷為5年隨訪（“早期”診斷），在5至10年隨訪期間，以及在10至15年隨訪期間（“晚期”診斷）。然而，該分析顯示，在所有三個與診斷時(shí)間相關(guān)的亞組中，歧視性化合物的數(shù)量相似。在診斷前<5年、5-10年和10-15年亞組中，BC和Ctr之間的效應(yīng)量（r>0.1）分別有16、18和18個（詳見補(bǔ)充表S4）;相應(yīng)的效應(yīng)大小中位數(shù)等于0.040、0.036和0.035（圖3A）。此外，當(dāng)分析一小群在參與HUNT2研究后一年內(nèi)被診斷患有癌癥的女性（n=30）時(shí)，與匹配的對照組相比，只有少數(shù)代謝物顯示出顯著不同的水平（3種化合物具有中等效應(yīng)量r>0.3，效應(yīng)量中位數(shù)等于0.073;附表S5）。盡管如此，我們觀察到幾種代謝物，其在BC病例中的濃度與診斷時(shí)間相關(guān)（圖3B;附表S6）。有趣的是，我們注意到參與者的年齡（在樣本采集時(shí)）與癌癥診斷時(shí)間（隨訪時(shí)間）之間存在統(tǒng)計(jì)學(xué)上的顯著負(fù)相關(guān)（補(bǔ)充圖S5）。我們發(fā)現(xiàn)，在早期發(fā)現(xiàn)癌癥的BC病例亞組（即<5年隨訪）中，老年女性（>64歲）的比例過高，而在晚期發(fā)現(xiàn)癌癥的BC病例亞組（即10-15年隨訪）中，年輕女性（<45歲）的比例過高，如圖3C所示.這一觀察表明，代謝物濃度與癌癥診斷時(shí)間之間的相關(guān)性是代謝物濃度與參與者年齡之間更強(qiáng)的相關(guān)性的函數(shù)（這可以通過與診斷時(shí)間相關(guān)性最強(qiáng)的化合物來舉例：瓜氨酸、PC（39：5）和血清素）。然而，這一觀察結(jié)果表明，應(yīng)分別分析年齡亞組中“早期診斷”和“晚期診斷”病例之間的假設(shè)差異。

圖3早期和晚期診斷為乳腺癌的HUNT2研究參與者診斷前血清樣本中的代謝組圖譜

（A）代謝物的分布顯示，在隨訪期間5年（早期）癌癥診斷時(shí)間不同的三個參與者亞組中，BC與相應(yīng)對照之間的差異幅度增加;5-10年;和10-15年（晚）。（B）診斷前樣本中血清代謝物濃度與癌癥診斷時(shí)間之間相關(guān)性的重要性。（C）納入研究期間不同年齡的婦女（<45歲、45-64歲和>64歲）在5年內(nèi)診斷出的BC病例亞組（早期）的貢獻(xiàn);5-10年;和10-15年（晚期）隨訪。（D）代謝物的分布顯示，在三個年齡定義的參與者亞組（<45歲、45-64歲和>64歲）中，早期（<5歲）和晚期（10-15歲）診斷為乳腺癌的參與者之間的差異幅度增加。（E）代謝物的分布，顯示BC與相應(yīng)對照組之間差異的幅度增加的四個參與者亞組，年輕/早期診斷;年輕/晚期診斷;老年/早期診斷;和較老/較晚的診斷。（F）選定代謝物濃度的差異（Asn;Trp;和LPC（18,1））在BC病例和對照組之間，在四個參與者亞組中，更年輕/早期診斷;年輕/晚期診斷;老年/早期診斷;和較老/晚期診斷;早期和晚期癌癥診斷的參與者的診斷前樣本的差異也被標(biāo)記出來（#-微小效應(yīng)量;##-中等效應(yīng)量）。（G）與年輕和年長參與者亞組（分別為<45歲和>64歲）以及早期和晚期癌癥診斷的年輕和年長參與者（分別為<5年和10-15年隨訪）中BC病例和對照組之間水平不同的化合物相關(guān)的代謝途徑;顯著高表達(dá)的通路標(biāo)有星號（點(diǎn)的大小對應(yīng)于與給定通路相關(guān)的分化化合物的數(shù)量）。

3.6不同癌癥診斷時(shí)間的女性的代謝特征取決于她們的年齡

我們注意到，在年輕和年長參與者的亞組中，區(qū)分早期/晚期診斷的BC病例的代謝物數(shù)量相似：分別有104種和93種代謝物的效應(yīng)量高于可忽略不計(jì)（r>0.1）;效應(yīng)大小的中位數(shù)分別等于0.078和0.065（圖3D）。然而，不同的代謝物區(qū)分了兩個年齡定義的亞組中早期和晚期診斷的病例（補(bǔ)充表S7）。此外，我們檢索了根據(jù)癌癥診斷年齡和時(shí)間定義的不同亞組中區(qū)分BC病例和對照組的代謝物（補(bǔ)充表S8）。在兩個年齡定義的亞組中，晚期診斷癌癥的BC和Ctr代謝物數(shù)量高于早期診斷的癌癥，并且差異的顯著性在年輕女性亞組中最高（效應(yīng)量中位數(shù)等于0.109;圖3E）。然而，不同的代謝物區(qū)分了不同年齡定義和診斷相關(guān)亞組中的BC病例和對照，圖3F中的3種化合物舉例說明了這一點(diǎn)。例如，與早期發(fā)現(xiàn)的BC病例相比，晚期發(fā)現(xiàn)的BC病例的血清天冬酰胺（Asn）濃度顯著高于僅在老年女性亞組中的早期發(fā)現(xiàn)的BC病例。另一方面，在患有晚期癌癥的老年女性的情況下，這種氨基酸在BC樣本中的濃度較高（與Ctr樣本相比），而在患有晚期癌癥的年輕女性的情況下，其在BC樣本中的濃度較低。為了進(jìn)一步分析這些與年齡和診斷相關(guān)的差異，確定了與不同歧視性化合物集相關(guān)的代謝途徑。我們發(fā)現(xiàn)，與區(qū)分BC和Ctr病例的化合物相關(guān)的一些代謝途徑，包括支鏈氨基酸的降解和谷胱甘肽代謝，在年輕（<45歲）和年長（>64歲）女性中有所不同（圖3G）。僅在老年婦女亞組中觀察到與區(qū)分早期和晚期診斷癌癥的代謝物相關(guān)的通路（His代謝和Ala代謝）的過度代表。因此，這一觀察結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了與乳腺癌風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)的代謝特征的年齡相關(guān)性質(zhì)。

4討論

在這項(xiàng)研究中，通過基于人群的HUNT2研究的900多名健康參與者的診斷前血清樣本進(jìn)行了分析，以確定血清代謝組的定量特征。分析組包括在15年觀察期內(nèi)被診斷患有乳腺癌的女性和在隨訪期間保持無乳腺癌的年齡匹配女性。這使我們能夠搜索與乳腺癌風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)的成分。這項(xiàng)工作的設(shè)計(jì)與最近使用不同分析平臺和針對不同隊(duì)列進(jìn)行的其他一些研究具有相似的設(shè)計(jì)。在我們的研究中觀察到血清代謝物濃度與參與者的年齡之間存在很強(qiáng)的相關(guān)性，這推測反映了由于與年齡相關(guān)的荷爾蒙平衡變化而導(dǎo)致的能量和脂質(zhì)代謝的適應(yīng)。老年女性的雌激素水平降低和雄激素水平升高，再加上生活方式的改變，會影響整體能量代謝和體脂再分配。內(nèi)臟脂肪的脂肪分解增強(qiáng)導(dǎo)致產(chǎn)生過量的游離脂肪酸，這與減少β氧化相結(jié)合增加了脂質(zhì)合成。此外，除了脂質(zhì)和脂肪酸外，血清氨基酸的濃度也隨著女性年齡的增長而變化。因此，年齡是導(dǎo)致數(shù)據(jù)存在巨大異質(zhì)性的主要混雜因素，影響了發(fā)現(xiàn)與乳腺癌風(fēng)險(xiǎn)較高相關(guān)的歧視性成分的能力。因此，在年齡匹配的病例對照對的較小亞組中進(jìn)行了分析。然而，必須指出的是，以前發(fā)表的報(bào)告涉及不同年齡的婦女群體;平均年齡從45歲到68歲不等。因此，不同受試者的年齡（以及不同的分析平臺）可能導(dǎo)致已發(fā)表的關(guān)于特定代謝物的研究之間可能存在差異。

我們發(fā)現(xiàn)，幾種特定的代謝物在最終患乳腺癌的女性和匹配的對照組之間顯示出不同的血清濃度，但這種差異的效應(yīng)量相對較低。因此，假設(shè)屬于同一類脂質(zhì)的化合物可能存在功能冗余，則還解決了脂質(zhì)類別的聚集濃度。我們發(fā)現(xiàn)，在年輕和中年女性群體中，特別是45歲以下的女性，甘油酯（甘油二酯和甘油三酯）、磷脂酰膽堿和鞘脂（神經(jīng)酰胺和鞘脂）水平升高與癌癥風(fēng)險(xiǎn)降低有關(guān)。這一一般性意見與以前發(fā)表的報(bào)告的結(jié)果一致。Brantley及其同事報(bào)告說，在美國護(hù)士健康研究中，聚不飽和甘油三酯和膽固醇酯與乳腺癌呈負(fù)相關(guān)。他和同事使用當(dāng)前研究中應(yīng)用的早期版本的分析平臺，在歐洲癌癥前瞻性調(diào)查（EPIC）隊(duì)列中顯示幾種磷脂酰膽堿和鞘磷脂與乳腺癌風(fēng)險(xiǎn)呈負(fù)相關(guān)。值得注意的是，在我們的研究中發(fā)現(xiàn)了該報(bào)告中深入研究的兩種特定代謝物?；鈮AAC（2：0）和PC（36：3）的類似風(fēng)險(xiǎn)關(guān)聯(lián)（分別增加和降低風(fēng)險(xiǎn)）。此外，與Kühn及其同事進(jìn)行的研究類似，在患乳腺癌的女性中觀察到LPC水平降低（18：0）。因此，血清脂質(zhì)（尤其是甘油酯、磷脂酰膽堿和鞘脂）水平降低與乳腺癌風(fēng)險(xiǎn)增加之間的關(guān)聯(lián)，至少在年輕和中年女性中，在幾項(xiàng)獨(dú)立研究中作為一般觀察結(jié)果出現(xiàn)。

與上述基于MS的研究類似，法國SU.VI.MAX隊(duì)列中基于NMR的血漿分析顯示，甘油衍生化合物、不飽和脂質(zhì)和脂蛋白水平較低的女性患乳腺癌的風(fēng)險(xiǎn)更高。最近，我們小組在一大群HUNT2研究參與者（1199對病例對照）中對診斷前血清樣本進(jìn)行了另一項(xiàng)基于NMR的分析，該分析揭示了乳腺癌風(fēng)險(xiǎn)與VLDL顆粒（以及含TG的HDL顆粒）的幾個亞部分的負(fù)相關(guān)，特別是在絕經(jīng)前婦女亞組中使用同一組樣品，我們搜索了脂質(zhì)物質(zhì)水平（此處由MS分析）和脂蛋白顆粒（先前通過NMR分析）之間的相關(guān)性。眾所周知，甘油三酯是VLDL顆粒的主要成分，膽固醇和膽固醇酯是LDL顆粒的主要成分，膽固醇和磷脂是HDL顆粒的主要成分。我們的相關(guān)性分析結(jié)果符合這種一般模式，增加了一些有趣的擴(kuò)展，例如VLDL顆粒中某些甘油二酯、磷脂酰膽堿、神經(jīng)酰胺和鞘磷脂的可能富集。然而，發(fā)現(xiàn)差別性VLDL顆粒與差別性甘油三酯（和某些磷脂）之間存在很強(qiáng)的相關(guān)性，這進(jìn)一步證實(shí)了血清脂質(zhì)作為乳腺癌風(fēng)險(xiǎn)潛在標(biāo)志物的穩(wěn)健性。

除脂質(zhì)外，本研究還討論了幾種“小分子”代謝物（氨基酸、生物胺和己糖）的血清濃度，這些化合物也與乳腺癌風(fēng)險(xiǎn)有關(guān)（盡管由效應(yīng)大小確定的差異大小相對較低）。然而，一些氨基酸顯示出與先前研究描述的乳腺癌風(fēng)險(xiǎn)相似的相關(guān)趨勢。這包括降低癌癥風(fēng)險(xiǎn)與較高水平的Arg，Gln，Lys和Thr之間的關(guān)聯(lián)，以前由其他人報(bào)道。此外，當(dāng)確定與風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)化合物相關(guān)的代謝途徑時(shí)，在我們的研究和Yoo及其同事的研究中都發(fā)現(xiàn)了參與芳香族氨基酸（Phe、Tyr、Trp）和支鏈氨基酸（Val、Leu、Ile）代謝的途徑。因此，血清中特定氨基酸水平的降低似乎是與乳腺癌風(fēng)險(xiǎn)增加相關(guān)的一般代謝特征。值得注意的是，已知與乳腺癌風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)的代謝物是實(shí)際乳腺癌中癌癥相關(guān)代謝的關(guān)鍵組成部分。例如，與三羧酸循環(huán)相關(guān)的谷氨酰胺代謝（在BC病例中推測與Gln和Glu水平降低有關(guān)）是支持癌細(xì)胞生長的重要途徑。在實(shí)際乳腺癌患者中觀察到與癌癥風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)的氨基酸（Ala，Arg，Ile，Leu，Tyr，Trp，Val）的血漿/血清水平降低。另一方面，氨基酸積累增加（以及與氨基酸相關(guān)的代謝途徑過度表達(dá)）是乳腺腫瘤的特征。因此，需要注意的是，循環(huán)氨基酸水平的降低可能與乳腺癌細(xì)胞典型的氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的過表達(dá)有關(guān)。

我們的研究中提供的數(shù)據(jù)與先前發(fā)表的報(bào)告一致，表明血清中幾種脂質(zhì)和氨基酸水平的降低與患乳腺癌的風(fēng)險(xiǎn)增加有關(guān)。據(jù)觀察，實(shí)際癌癥患者血液中某些代謝物水平的降低可能反映了由于癌細(xì)胞消耗這些代謝物的增加而增加向腫瘤組織的轉(zhuǎn)移。然而，癌細(xì)胞對代謝物的需求增加不太可能導(dǎo)致這些代謝物在隨訪期間患上癌癥但在采血時(shí)被認(rèn)為無癌的女性血清中濃度降低。人們可以假設(shè)，在納入研究后不久被診斷出患有癌癥的女性實(shí)際上可能在早期臨床前階段患有癌癥，但當(dāng)考慮整個隊(duì)列時(shí)，這些假設(shè)病例的影響會很低。盡管我們發(fā)現(xiàn)診斷前樣本中的代謝物濃度與乳腺癌診斷時(shí)間之間存在相關(guān)性，但這種相關(guān)性假定反映了年齡與診斷時(shí)間之間的反向相關(guān)性，以及代謝物濃度與年齡的強(qiáng)烈關(guān)聯(lián)。此外，對于早期（隨訪后5年內(nèi)）和晚期（隨訪超過10年后）診斷的女性，BC病例與相應(yīng)對照之間的差異程度相似。此外，即使在樣本采集后一年內(nèi)被診斷患有癌癥的女性亞組（即在樣本采集期間可能患有無癥狀疾病的女性）中，這種差異的程度也相對較低。此外，當(dāng)分別分析年齡定義的亞組時(shí)，晚期診斷病例的BC和對照組的代謝物比早期診斷病例的代謝物更多。因此，在隨訪期間最終患上癌癥的女性中檢測到的血清代謝組特征與影響其代謝的癌癥促進(jìn)/促能因素相關(guān)，而不是與臨床前/無癥狀疾病相關(guān)的代謝變化相關(guān)。

一般來說，乳腺癌是一種激素依賴性惡性腫瘤，因此影響激素穩(wěn)態(tài)的疾病是已知的危險(xiǎn)因素之一，包括生殖相關(guān)因素（例如，懷孕次數(shù)和年齡）和激素替代療法的使用。在我們的隊(duì)列中，多足月妊娠與乳腺癌風(fēng)險(xiǎn)降低有關(guān)，而全身使用HRT與癌癥風(fēng)險(xiǎn)增加有關(guān)，這引起了我們對與這兩種疾病相關(guān)的代謝變化的關(guān)注。HRT的使用顯著影響代謝和血清代謝譜（。一項(xiàng)較新的代謝組學(xué)研究表明，絕經(jīng)后使用雌激素（單獨(dú)或與孕激素聯(lián)合使用）會影響美國癌癥預(yù)防II營養(yǎng)隊(duì)列中約200種代謝物的血清濃度。一般來說，HRT使用者中幾種氨基酸，?；鈮A，鞘脂，磷脂酰膽堿和類固醇的水平降低（該研究未評估甘油三酯）。值得注意的是，在這些代謝物中，在我們的研究中，這些代謝物的水平降低與中老年女性癌癥風(fēng)險(xiǎn)增加有關(guān)（例如，Glu、Gly、LPC（18：0）或AC（18：2））。另一方面，據(jù)報(bào)道，絕經(jīng)后婦女的HRT與血清甘油三酯和VLDL顆粒水平升高有關(guān)。然而，一項(xiàng)更大規(guī)模的薈萃分析表明，HRT對膽固醇、甘油三酯和脂蛋白顆粒血清水平的影響取決于激素及其應(yīng)用方法的組合，這表明HRT與代謝之間的關(guān)聯(lián)更為復(fù)雜。然而，由于HRT應(yīng)用于絕經(jīng)后婦女，因此在一組年輕的絕經(jīng)前婦女中應(yīng)考慮其他影響代謝的風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)因素。其中包括懷孕，這需要母親復(fù)雜的生理適應(yīng)和重編程代謝。（多發(fā)性）足月妊娠與乳腺癌風(fēng)險(xiǎn)呈負(fù)相關(guān)，可能參與絕經(jīng)前婦女的代謝特征。因此，應(yīng)該提到的是，甘油三酯和膽固醇（總和脂蛋白）的濃度在正常懷孕期間增加。最近的一項(xiàng)代謝組學(xué)研究顯示，懷孕期間幾種氨基酸和磷脂（磷脂酰乙醇胺和磷脂酰膽堿）的水平升高。此外，這項(xiàng)研究顯示孕婦的LPC水平顯著降低，這類似于LPC水平普遍升高與乳腺癌風(fēng)險(xiǎn)增加之間的關(guān)聯(lián)。因此，與妊娠相關(guān)的代謝變化可能有助于在年輕女性群體中觀察到的血清代謝組特征。體重是另一種與激素和代謝相關(guān)的疾病，在分析的HUNT2隊(duì)列中未被確定為危險(xiǎn)因素。然而，其他幾種情況也可以被認(rèn)為是影響最終患癌癥的女性新陳代謝的假設(shè)因素。在一般的癌癥啟用/促進(jìn)特征中，慢性炎癥。據(jù)報(bào)道，在幾種炎癥相關(guān)疾病中，血清LPC水平升高。因此，在將患癌癥的女性血清中觀察到的LPC與PC的比率增加也符合致癌特征。

總之，在診斷前血清樣本中，最終患乳腺癌的女性和保持無乳腺癌的女性之間幾種代謝物的濃度存在差異。在基線（即在招募研究期間）檢測到的代謝組學(xué)特征以年齡依賴性方式與乳腺癌的長期風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)，并且主要可以在年輕（主要是絕經(jīng)前）女性中觀察到。據(jù)推測，代謝物譜的變化反映了與癌癥促進(jìn)條件相關(guān)的代謝的重編程，包括激素穩(wěn)態(tài)的變化。該研究表明，脂質(zhì)和氨基酸的代謝受損是乳腺癌的病因，可以在癌癥診斷前多年觀察到。然而，盡管參與者數(shù)量相對較多，并且應(yīng)用分析平臺的直接定量價(jià)值是該研究的優(yōu)勢，但特定代謝物與乳腺癌風(fēng)險(xiǎn)之間的關(guān)聯(lián)通常不大。因此，假設(shè)的代謝組學(xué)特征的預(yù)測價(jià)值似乎太低，無法應(yīng)用于癌癥篩查策略。另一方面，由于納入了一個相對龐大且異質(zhì)性的隊(duì)列，代謝物濃度與年齡之間的相關(guān)性已被令人信服地記錄下來，并被證明是癌癥風(fēng)險(xiǎn)生物標(biāo)志物導(dǎo)向研究的重要障礙。此外，與乳腺癌風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)的代謝組學(xué)概況的擴(kuò)展知識有助于根據(jù)改變的飲食和生活方式制定合理的預(yù)防策略。